Полимеразная цепная реакция. ПЦР анализ - что это такое: как и где сдать. ПЦР в гинекологии

В современной медицине проведение ПЦР анализа биологических жидкостей организма является высокоточным и информативным. При помощи данного анализа выявляют наличие в организме вирусных и микробных частиц, даже если болезни протекают скрыто и не дают никаких симптомов.

Что значит назначение вам ПЦР анализа? Эта аббревиатура расшифровывается как метод полимеразной цепной реакции - это особый способ проведения лабораторных исследований. При данном методе полученный от пациента биологический материал размещается в специальном аппарате. К исследуемой среде прибавляют набор ферментов-реактивов, которые помогают воспроизводить генетический материал возбудителя (вируса или микроба). При реакции воспроизводится большое количество копий ДНК или РНК, что позволяет идентифицировать путем сравнения с базой данных как вирусную, так и микробную инфекцию.

Что означает результат ПЦР анализа? Если в организме человека имеется возбудитель каких-либо инфекций, даже скрытый, при данном анализе будет выявлено не только его наличие, но и в каком количестве данная инфекция присутствует в теле.

Для анализа на инфекции методом ПЦР можно исследовать все биологические жидкости организма - кровь, моча, слюна, выделения половых органов, слизь горла и носа. Для анализа требуется совсем немного материала, так как если возбудители имеются, за счет воспроизведения их копий, концентрация генетической информации доводится до такой, которая выявит микроб или вирус, и определит его вид. Точность анализа ПЦР очень высока, при помощи данного анализа можно на сегодня определить практически все широко распространенные вирусные, микробные и иные инфекции.

Но, что же чаще всего выявляет анализ ПЦР? К списку инфекций, которые можно выявить данным методом можно отнести инфекционные, в том числе и социально опасные инфекции по типу туберкулеза или гепатитов В и С. Этим же методом можно выявить ВИЧ-инфекцию, хламидийную и уреаплазменную инфекции, микоплазмоз как респираторной системы, так и генитальный. При помощи данного анализа выявляют молочницу, бактериальный вагиноз, трихомониаз. Возможности данного метода позволяют выявлять скрытые инфекции - герпес разных типов, ВПЧ (папилломавирус), а также выявление особого микроба, ответственного за развития язв желудка - хеликобатера.

Сегодня сдать анализ методом ПЦР можно практически в любой частной или государственной лаборатории. Данные виды анализов проводят всем, детям и взрослым. В зависимости от того, какую цель преследует анализ, в зависимости от пола проводятся анализ разного биологического материала.

Так, анализ ПЦР у мужчин проводит по крови или моче, секрету уретры, слизи из глотки или носа, соку простаты или даже сперме. Проведение анализа ПЦР у женщин возможно в крови и моче, влагалищном секрете, выделениях из уретры, слизи носа и глотки.

Очень часто применяют анализ ПЦР при беременности, с его помощью во влагалищном секрете или крови выявляют скрытые инфекции, требующие особого наблюдения в этот период, а иногда и адекватного лечения.

ПЦР как берут анализ

Анализ на инфекции данным методом назначает врач, зачастую сбор материала проводится сразу в кабинете доктора - уролога или гинеколога. Как делается анализ ПЦР?

Исследуемый материал в лаборатории смешивают с реактивами и ждут реакции. При наличии возбудителей, копии их ДНК или РНК размножаются. Выявленные фрагменты генетического материала аппарат сравнивает с базами данных и точно выявляет возбудителя инфекции. Пи необходимости, также указывается и количество возбудителя в тех или иных жидкостях тела. Обычно исследование длится не более 1-2 суток, при необходимости - проводят экспресс-анализы.

Откуда берут анализ ПЦР? Это будет зависеть от того, какие виды возбудителя предполагаются. Если это ВИЧ или гепатиты - берется кровь, если это половые инфекции - берется мазок с уретры или влагалища. При подозрении на мононуклеоз или герпес берут мазок с горла. Также могут использоваться моча, спинномозговая жидкость, отделяемое из ран, мокрота и тд.

Анализ крови ПЦР

Для точных результатов и диагностики инфекций важно сдавать кровь в утренние часы натощак. Анализ крови методом ПЦР способен выявить возбудителей опасных заболеваний - ВИЧ, гепатиты, сифилис. В периоды обострения и активности вируса в крови могут быть выявлены вирусы герпеса, папилломы и некоторые другие.

ПЦР анализ: подготовка

Для абсолютной точности анализа важна правильная к нему подготовка. Проще всего подготовиться к анализу крови, никаких ограничений в диете или активности нет, кровь нужно сдать утром, натощак. Анализ мочи сдают после подмывания гениталий, из средней порции в специальный стерильный контейнер. Анализ ПЦР из половых путей заслуживает особого внимания, поэтому важно знать, как подготовиться. За сутки до обследования запрещается секс, перед исследованием рекомендовано не мочиться. При менструации у женщин, дата анализа переносится на 3-5 дней с момента последних выделений.

Сколько времени делается анализ ПЦР

Анализ в зависимости от возможности лаборатории может готовиться от нескольких часов до нескольких дней. В среднем, сколько дней делается анализ ПЦР? Обычно это одни -двое суток. При экстренной ситуации анализ может быть выполнен в этот же день, через несколько часов.

Для адекватного и эффективного лечения многих инфекционных заболеваний необходимо своевременное установление точного диагноза. В решении этой задачи в наши дни привлекаются высокотехнологичные методы диагностики основанные на методах молекулярной биологии. В настоящий момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) уже достаточно широко применяется в практической медицине как наиболее надежный инструмент лабораторной диагностики .

Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?

Во-вторых, для контроля эффективности проведенного лечения.

В различных руководствах, проспектах, статьях, а также объяснениях врачей-специалистов, мы часто сталкиваемся с употреблением непонятных терминов и слов. Действительно трудно рассказать о высокотехнологичных продуктах науки обыденными словами.

В чем суть и механика ПЦР диагностики?

ПЦР диагностика – генетическое исследование биоматериала.

Разберемся с терминологией, что же это такое – ДНК и т.д. Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа.

Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. ДНК – химически это дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из структурных компонентов – нуклеотидов. Нуклеотидов бывает 5 видов – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, ген, кодирующий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

Нуклеотиды имеют свойство комплементарности. Это означает что напротив аденина (А) в одной цепочке ДНК обязательно стоит тимин (Т) в другой цепочке, а напротив гуанина (Г) – цитозин (Ц). Схематически выглядит следующим образом:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Данное свойство комплементарности ключевое для проведения ПЦР.

Помимо ДНК такую же структуру имеет РНК – рибонуклеиновая кислота, отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил. РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами (например, ВИЧ).

Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться» (данное свойство используется для проведения ПЦР). Происходит это следующим образом: две нити ДНК или РНК, отходят друг от друга в стороны, на каждую нить садится специальный фермент, который синтезирует новую цепочку. Синтез идет по принципу комплементарности, то есть, если в исходной цепочке ДНК стоит нуклеотид А, то во вновь синтезированной будет стоять Т, если Г – то Ц и т.д. Этот специальный фермент -«строитель» для начала синтеза нуждается в «затравке» - последовательности из 5-15 нуклеотидов. Данная «затравка» определена для каждого гена (гена хламидии , микоплазмы , вирусов) экспериментально.

Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем». В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.

Этапы проведения ПЦР исследования

Забор биологического материала для исследования

В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат – термоциклер (амплификатор). В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов (денатурация, отжиг и удлинение). Что это означает? Рассмотрим подробнее.

Этапы непостредственно ПЦР реакции, копирование генетического материала

I

«Затравки» изготавливают промышленным способом различные научно-производственные объединения, а лаборатории покупают уже готовые. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т.д. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра.

II этап – Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».
Если имеется ДНК определяемого вируса или бактерии , «затравка» садится на эту ДНК. Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. Данная стадия проходит при температуре 75°С.

III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции.
Это процесс собственно удлинения или размножения генетического материала, который происходит при 72°С. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. С окончанием синтеза новой цепочки ДНК, заканчивается и цикл ПЦР. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Например, в исходной пробе имелось 100 молекул ДНК какого-либо вируса, после первого цикла ПЦР в пробе будет уже 200 молекул ДНК тестируемого вируса. Один цикл длится 2-3 минуты.

Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа.

Этап идентификации размноженного генетического материала

На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%. Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий:

1. корректный забор, транспортировка биологического материала;
2. наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала;
3. строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа

Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного.
Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний. Учитывая продолжительность выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущество метода ПЦР становится очевидным.

ПЦР в диагностике инфекций
Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине.
Основные области применения ПЦР-диагностики:

1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
2. контроль эффективности проведенной терапии
3. уточнение вида возбудителя

Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Их сочетание и целесообразность определяет лечащий врач.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2
2. герпетиформные вирусы
3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов

В диагностике инфекционных заболеваний используются различные лабораторные методы обнаружения возбудителей. Одним из наиболее прогрессивных, специфичных и точных лабораторных тестов является анализ методом ПЦР, позволяющий определять наличие возбудителей в крови и других видах биологического материала, обнаруживать микроорганизмы на первых стадиях развития болезни, в случаях носительства инфекции.

Анализ на ПЦР на специальной аппаратуре

Как проводят диагностические тесты с помощью ПЦР

Полимеразная цепная реакция – лабораторный молекулярно-биологический способ обнаружения ДНК бактерий и грибов, ДНК и РНК вирусов. Основа ПЦР – особая ферментативная реакция, протекающая в присутствии специальных ферментов и веществ молекулярной природы. Благодаря тому, что метод способен зафиксировать наличие непосредственно возбудителя болезни, его считают наиболее информативным и чувствительным при выявлении латентных инфекций и носительства по сравнению со всеми другими диагностическими методами.

Анализ биологических образцов с помощью ПЦР-тестирования позволяет быстро обнаружить присутствие самих бактерий и вирусов.

Остальные лабораторные способы диагностики, как правило, определяют косвенные признаки инфекции, либо требуют длительной процедуры проверки.

Основными стадиями ПЦР-методики являются:

• взятие биологического материала, его доставка в диагностическую лабораторию,
• выделение генетического материала бактерий и вирусов из взятого материала,
• непосредственно анализ ПЦР и расшифровка полученных данных.

Для постановки реакции ПЦР используют образцы жидкостей, тканей, секретов, в которых предполагают присутствие болезнетворных микроорганизмов. Чаще всего в качестве образцов для тестирования используют венозную кровь, плазму или сыворотку крови. В лаборатории бактериальные и вирусные частицы отделяют от остальных компонентов и с использованием специальных реагентов выделяют из них молекулы ДНК или РНК.

Полимеразная цепная реакция

На следующей стадии эти генетические молекулы многократно размножают в специальных приборах. Для этого используют особые ферменты и молекулы, которые позволяют искусственно размножить строго определенный вид ДНК, принадлежащий только одному конкретному возбудителю. В результате реакции образуется огромное количество коротких фрагментов ДНК, идентичных тем, что входят в состав вирусов и бактерий.

На третьем этапе накопленные фрагменты обнаруживают с помощью специальных красителей и оборудования для детекции. Если в исходном образце содержались болезнетворные микроорганизмы, в результате реакции образуется специфический продукт, и анализ показывает положительный результат. Если возбудителя в материале не было, продукт реакции не синтезируется и тест дает отрицательный результат.

Тестирование методом ПЦР – один из самых быстрых способов диагностики инфекций. Полный цикл проверки материала занимает от нескольких часов до одного дня.

Метод ПЦР — суть

Именно использование в реакции многократного размножения молекул ДНК строго определенного вида позволяет точно определять наличие микроорганизмов в биологических образцах с предельной чувствительностью. Даже незначительная концентрация инфекционных агентов в тканях и жидкостях организма может привести к синтезу огромного количества продукта реакции и положительному заключению.

Какие инфекции определяют ПЦР-тестом

С помощью технологии ПЦР детектируют присутствие самых разных бактерий, дрожжеподобных клеток, вирусных частиц. В современной диагностической практике анализ ПЦР наиболее распространен для выявления возбудителей следующих заболеваний:

• ВИЧ-инфекция (СПИД),
• гепатиты (гепатит B, гепатит С и другие более редкие разновидности),
• цитомегаловирусная инфекция,
• практически все инфекционные заболевания мочеполового тракта,
• кандидоз,
• микоплазмоз,
• инфекции, вызванные герпес-вирусами,
• папилломовирусная инфекция,
• токсоплазмоз,
• кишечные заболевания,
• дифтерия,
• туберкулез,
• редкие очаговые инфекции,
• мононуклеоз и многие другие.

Полимеразная цепная реакция – самый распространенный, достоверный и быстрый метод обнаружения половых инфекций, гепатита, ВИЧ, папиллом и других заболеваний.

Для многих диагностируемых заболеваний ПЦР не является единственным способом диагностики. Диагноз подтверждается врачом только при наблюдении других признаков болезни.

Схема выявления вирусов и бактерий

Но для целого ряда случаев полимеразная реакция является «золотым стандартом» лабораторной диагностики.

Список обнаруживаемых с помощью ПЦР инфекций расширяется с каждым годом. Развитие метода уже позволило определять одновременно несколько возбудителей. Это послужило распространению комплексных программ обследований. Среди них: комплексное исследование микрофлоры на бактериальный вагиноз, определение TORCH-инфекций, выявление папиллом человека высокого и низкого канцерогенного риска. Кроме того, анализ крови ПЦР входит в обязательный госпитальный комплекс диагностики.

С использованием полимеразной реакции ученые смогли определить молекулы, сигнализирующие о развитии разных форм злокачественных опухолей — онкомаркеры. Благодаря чему метод нашел применение в раннем выявлении рака. ПЦР-тесты активно используют для обнаружения наследственных генетических дефектов, в том числе в пренатальной диагностике и в процессе планирования беременности.

Особенности биологического материала для анализа ПЦР

Забор определенного вида материала для исследования определяется типом инфекции, которую хотят диагностировать в результате тестирования. В качестве исследуемых образцов выполняют забор:

• венозной крови,
• слюны,
• соскобов, например из цервикального канала, с внутренней стороны щеки,
• образцов слизи,
• мочи,
• плевральной жидкости,
• образцов спермы и секрета предстательной железы,
• мокроты и бронхо-легочного лаважа,
• выделений из уретры.

Результаты могут расшифровать только специалисты

В случае отдельных инфекций и при особых показаниях врачи могут назначить анализ спинномозговой жидкости. В обнаружении внутриутробных заболеваний применяют образцы плаценты и околоплодных вод.

В общем случае для диагностики с помощью ПЦР используют тот вид материала, в котором с большой вероятностью присутствует непосредственно сам возбудитель заболевания. Вид биологического материала определяется врачом при направлении на анализ.

Чтобы анализ был точным и правильным необходима простая подготовка перед забором материала и соблюдение особой чистоты взятия образов и проведения самого анализа.

Для получения точного результата анализа следует придерживаться нескольких правил подготовки и забора материала на исследование:

• отменить половые контакты за несколько дней до забора материала из половых органов и в случае диагностики половых инфекций по анализу крови,
• венозную кровь на ПЦР анализ сдавать утром, перед сдачей не употреблять напитки и еду,
• не курить минимум за два часа до сдачи крови,
• мочу собирать строго в стерильный контейнер сразу после сна.

Важно! Прием антибиотиков и других лекарственных препаратов может исказить результаты анализа. Перед сдачей материала следует проконсультироваться с врачом.

Если для выполнения анализа ПЦР планируется забор материала из половых органов, рекомендуется отменить использование антибактериальных гигиенических средств и сильнодействующих лекарственных препаратов по согласованию с лечащим врачом.

Как расшифровать результат анализа ПЦР

Результаты ПЦР-анализа обычно представлены в качественном формате. Инфекционный агент либо обнаруживается в образце биологического материала, либо не детектируется в нем.

Интерпретация заключения в этом случае максимально проста:

• положительный результат свидетельствует о том, что микроорганизм присутствовал в анализируемом образце,
• отрицательный тест указывает на то, что инфекционный агент не был обнаружен.

Внимание! Отрицательный результат иногда является следствием неправильного забора материала или ошибок в процессе проведения анализа.

При наличии явных симптомов заболевания и подозрении на ложноотрицательный результат может быть целесообразно повторить исследование.

Проведение анализа ПЦР требует большой точности

В особых случаях используют количественные методы определения возбудителя. Результаты таких анализов выдаются в виде полученной концентрации ДНК или РНК возбудителя в пересчете на определенный объем материала. Например, в копиях молекул ДНК на миллилитр плазмы крови.

Количественный и полуколичественный анализ ПЦР и расшифровка его результатов выполняются для мониторинга течения заболевания, определения вирусной нагрузки, выявления стадии болезни, диагностики заболеваний, вызванных условными патогенами.

Положительные стороны диагностики методом ПЦР

Активное внедрение метода полимеразной цепной реакции в диагностику такого широкого спектра инфекционных болезней стало возможным благодаря целому ряду его преимуществ:

• высокая специфичность метода – анализ позволяет обнаруживать строго определенный вид ДНК возбудителей,
• возможность постановки анализа на поток и автоматизации процесса,
• высокая чувствительность метода и возможность диагностировать болезнь на ранних стадиях,
• диагностика одновременно нескольких инфекций;
• быстрота процедуры и небольшая стоимость расходных материалов.

К недостаткам метода можно отнести необходимость дорогостоящего оборудования, высокие требования к чистоте и технологичности лаборатории, возможность получения ложных результатов при несоблюдении методики анализа.

Очень важно выполнить полноценное обследование будущей мамы для того, чтобы вовремя провести лечение возможной патологии и предупредить развитие серьёзных осложнений. Одним из таких обследований является анализ на инфекции, передающиеся половым путём , который проводится при помощи метода ПЦР диагностики .

   ПЦР диагностика (полимеразная цепная реакция) - это один из современных и наиболее достоверных методов выявления инфекций в организме человека. Этот метод позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе (исследуемом материале) тот присутствует в незначительной концентрации - всего несколько молекул его ДНК или РНК, что делает этот метод наиболее точным.

   Проводится анализ следующим образом: в пробирке многократно копируют определённый участок ДНК бактерии или вируса, добавляя специальные реактивы. Размножив таким способом клетки возбудителя инфекции, впоследствии легко определить её наличие.

Когда проводят ПЦР диагностику?

   Анализы на инфекции во время беременности обычно берутся при постановке на учёт в женской консультации. К сожалению, не во всех женских консультациях ПЦР диагностика проводится бесплатно. Собственно и не во всех лабораториях проводят ПЦР диагностику. В таком случае врач выдаёт направление в частную лабораторию или клинику.

   Анализ на инфекции в любом случае является очень важным во время беременности. Так как большинство инфекций, которые передаются половым путём, протекает бессимптомно, не вызывая никакого дискомфорта, однако может приводить к серьёзным осложнениям беременности, например, к преждевременным родам , задержке внутриутробного развития плода , порокам развития плода.

   Обследование на половые инфекции обязательно должны пройти женщины, у которых предыдущие беременности прерывались на разных сроках, а также пациентки, в мазках которых обнаружены признаки воспалительного процесса (увеличение количества лейкоцитов).

   Проводить ПЦР диагностику желательно до 12-й недели беременности, так как при наличии заражения врач назначит поддерживающее лечение, которое снижает риск осложнений, а после 16 недель - проведёт полноценное лечение. Примерно через 3 недели после окончания лечения обязательно делается контрольный анализ ПЦР для оценки его эффективности.

Как проводится ПЦР диагностика?

   Мазок на ПЦР диагностику врач-гинеколог берёт специальной щёточкой из канала шейки матки, когда беременная женщина находится на гинекологическом кресле. Эта процедура абсолютно безболезненная. Полученный материал помещается в пробирку со специальной средой и отправляется в лабораторию.

   Какой-либо особой подготовки к проведению анализа не требуется. Желательно для более точного результата в течение двух дней не спринцеваться и избегать сексуальных контактов. Кроме того, мазок берётся не раньше чем через три дня с момента окончания использования влагалищных свечек.

   При помощи ПЦР диагностики выявляются такие инфекции как: хламидиоз, микоплазмоз и уреаплазмоз, герпес, цитомегаловирусная инфекция, папилломавирусная инфекция.

Хламидиоз

   На ранних сроках беременности заражение хламидиозом может привести к выкидышу, может привести к неразвивающейся беременности, к задержке внутриутробного развития плода. На более поздних сроках беременности возможны:

   - поражение плаценты (плацентит) и оболочек плода (хориоамнионит);

   - проникновение хламидий к ребёнку с развитием внутриутробной пневмонии (воспаления лёгких);

   - формирование пороков в развитии плода.

   Ребёнок может заразиться хламидиозом во время родов, проходя через родовые пути матери. При этом чаще всего поражаются глаза новорожденного (происходит развитие хламидийного конъюнктивита), что приводит к серьёзным осложнениям, вплоть до полной слепоты.

   Если хламидиоз был выявлен во время беременности, то обязательно проводится лечение антибиотиками будущей мамы и отца ребёнка. После курса терапии необходимо сдать повторный анализ ПЦР на наличие хламидий.

Микоплазмоз и уреаплазмоз

   Микоплазмы - это группа бактерий, которая включает в себя более 40 видов. Во время беременности обследование проводится на присутствие трёх видов микоплазм:

   - микоплазма гениталиум, микоплазма хоминис, уреаплазма уреалитикум.

   Уреаплазмоз и микоплазмоз часто протекают без каких-либо симптомов. У некоторых беременных женщин могут быть выделения из половых путей.

   Микоплазменная инфекция несёт угрозу выкидыша на ранних сроках беременности, нарушения развития плода, многоводия, дисфункции плаценты, инфицирования плодных оболочек (хориоамнионит), поражения плода (наиболее часто развивается внутриутробная пневмония или поражается нервная система ребёнка).

   При микоплазмозе в 2 - 3 раза возрастает вероятность преждевременных родов. Во время родов прохождение через родовые пути заражённой матери может привести к поражению микоплазмами бронхов или лёгких младенца. Кроме того, микоплазменная инфекция является частой причиной инфекционных осложнений у женщины после родов (например, послеродовый эндометрит - воспаление слизистой оболочки матки).

   Важнейшее значение имеет выявление при помощи ПЦР диагностики микоплазмы гениталиум, так как эта бактерия является для человека абсолютным патогеном. Её присутствие в пробе свидетельствует о хроническом воспалительном процессе и во всех случаях требует антибактериального лечения. Антибиотики назначаются женщине после 16-ти недель беременности, а также её половому партнёру. Через три недели после окончания приёма препаратов обязательно сдаются контрольные анализы ПЦР на микоплазму гениталиум.

   Микоплазма хоминис и уреаплазма не являются абсолютными патогенами, то есть не всегда их выявление говорит о наличии воспалительного процесса и необходимости лечения. Эти бактерии могут встречаться в организме здоровой женщины и входят в состав нормальной микрофлоры влагалища.

   Если во время беременности была выявлена микоплазма хоминис или уреаплазма, то обычно назначаются дополнительные анализы - количественные. Это специальные посевы, которые показывают, в каком количестве бактерии присутствуют в организме женщины. Точкой отсчёта принято считать 10 4 КОЕ/мл. Если количество микоплазм или уреаплазм меньше этого значения, то лечение не проводят. В противном случае беременной женщине и её партнёру назначают антибактериальную терапию, с обязательным повторным анализом ПЦР на эти бактерии через три недели после проведённого курса лечения.

   Кроме того, при решении вопроса о необходимости терапии микоплазмоза и уреаплазмоза учитываются данные ультразвукового исследования. Если концентрация бактерий меньше, чем 10 4 КОЕ/мл, однако при УЗИ выявляются признаки воспалительного процесса в плаценте, плодных оболочках или околоплодных водах, проводится лечение антибиотиками.

Герпес

   Герпес - это вирус, который поражает слизистые оболочки и кожу. Этот вирус распространяется воздушно-капельным, контактным, бытовым, а также половым путём.

   Вирус простого герпеса (ВПГ) бывает двух типов: первый тип вызывает поражение слизистой губ, кожи лица (лабиальный герпес) - ВПГ-1, второй тип чаще поражает слизистую половых органов (генитальный герпес) - ВПГ-2. Однако в некоторых случаях генитальный герпес может быть вызван вирусом герпеса 1-го типа.

   Инфекция герпеса является хронической, то есть после заражения вирус не выводится из организма полностью и присутствует в нём пожизненно, встраиваясь в генетическую цепочку нервных клеток человека.

   Среди признаков заболевания могут быть: болезненность, раздражение и зуд в области половых органов, появление пузырьков и маленьких язвочек на слизистых оболочках. Однако довольно часто болезнь протекает без каких-либо симптомов.

   Во время протекания беременности может произойти как первичное заражение женщины вирусом простого герпеса, так и активация уже имеющейся инфекции - из-за снижения иммунитета, характерного для нормально протекающей беременности.

   При первичном заражении герпесом течение беременности подвергается большому риску осложнений, тяжесть которых определяется в первую очередь сроком беременности. Чем меньше срок беременности, тем серьёзнее осложнения.

   Заражение вирусом герпеса в первые 12 недель очень часто приводит к прерыванию беременности, возникновению у плода пороков развития, инфицированию плода с поражением кожи, печени и нервной системы.

   На более поздних сроках беременности есть риск преждевременных родов, многоводия или маловодия, и также сохраняется вероятность инфицирования плода.

   Гораздо меньшую опасность представляет для беременной женщины обострение хронической формы герпеса. В данном случае риск патологий развития плода будет минимальным. Однако если у будущей мамы генитальный герпес обостряется на момент родов, то существует вероятность заражения ребёнка при его прохождении через родовые пути.

   В случае положительной ПЦР на вирус простого герпеса проводится лечение противовирусными и иммуномодулирующими препаратами.

Цитомегаловирусная инфекция

   Цитомегаловирус (ЦМВ) - это вирус семейства герпесвирусов, все представители которого имеют свойство постоянного нахождения в организме человека после заражения. Сам по себе цитомегаловирус не очень заразен: для его передачи требуются частые и тесные контакты с носителем вирусной инфекции.

   Передаётся данная инфекция воздушно-капельным, бытовым и половым путём. Время от времени вирус может активироваться, интенсивно выделяясь через мочеполовые и дыхательные пути. Заражение цитомегаловирусом чаще всего протекает бессимптомно.

   Первичное заражение цитомегаловирусом во время беременности может привести к возникновению пороков развития у плода, задержке внутриутробного развития, глухоте, умственной отсталости, к недостаточности функции плаценты, прерыванию беременности. Ребёнок может заразиться во время родов (при прохождении через родовые пути) и через материнское молоко (при кормлении грудью).

   Лечение цитомегаловирусной инфекции во время беременности проводят иммунологическими препаратами.

Папилломавирусная инфекция

   В настоящее время известно более 100 различных типов вируса папилломы человека (ВПЧ), которые условно можно разделить на три группы:

   - неонкогенные (не способные вызвать опухолевый процесс);

   - низкого онкогенного риска;

   - высокого онкогенного риска (с большой вероятностью могут привести к раку).

   Передаётся папилломавирусная инфекция, как правило, половым путём, однако возможно заражение во время медицинских манипуляций. Новорожденный может заразиться при прохождении через родовые пути заражённой мамы.

   Наличие папилломавирусной инфекции в организме иногда становится причиной появления кондилом (выросты на слизистой оболочке) в области половых органов, во влагалище, на шейке матки, а также различных поражений шейки матки, вплоть до онкологического процесса.

   Однако чаще всего носительство папилломавирусной инфекции протекает абсолютно бессимптомно. Выявление ВПЧ во время беременности, при отсутствии клинических проявлений, не требует медицинского вмешательства.

   При наличии сопутствующих изменений на шейке матки (например, кондилом) необходимо более пристальное внимание к ней и проведение дообследования - кольпоскопии (осмотр шейки матки при помощи микроскопа) и взятия мазка на онкоцитологию (выявление нетипичных для нормальной слизистой оболочки клеток) для решения вопроса о необходимости лечения шейки матки.

   Мелкие кондиломы также не лечатся во время беременности, удаляются только очень крупные или активно растущие кондиломы, которые могут помешать нормальному рождению ребёнка.

   Заражение папилломавирусной инфекцией с поражением дыхательных путей новорожденного (папилломатозом гортани) во время прохождения через родовые пути происходит достаточно редко. Поэтому наличие мелких кондилом влагалища или наружных половых органов у беременной женщины не является показанием к операции

Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.

Впервые этот метод разработал К. Мюллис (США) в 1983 т. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простоте выполнения его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.

Суть метода - амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-цитозин.

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер - это фрагмент ДНК, состоящий из 20-30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.

Обычно ПЦР ставят в 25-40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый - денатурация при 92-95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй - отжиг, или присоединение праймеров при 50-65 °С; третий - элонгация, или полимеризация при 68-72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов насинтезировать миллионы (2 n) фрагментов ДНК - количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.

Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня.

С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.

В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность - мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце - блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’-3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода - проблема контаминации ампликонами.

Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.

Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.

ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .