Среда для выделения гонококка сухая. Питательные среды для выращивания гонококков. Посев на гонорею из глаза
Набор реагентов «Питательная среда для выделения гонококка сухая» (ГНК агар) предназначен для микробиологических целей. Применяется для выделения гонококка при исследовании инфицированного материала, а также в качестве среды для культивирования и хранения гонококка в научно-исследовательской работе.
Набор реагентов выпускается в виде комплекта из двух лиофилизированных компонентов:
- основы питательной среды - лиофилизат из объема 100 мл в бутылке- 1 шт;
- добавка к основе питательной среды - лиофилизат из объема 24 мл в бутылке - 1 шт
Состав : основа питательной среды - экстракт кроличьего мяса, пептон сухой ферментативный для бактериологических целей, натрий хлористый, аутолизат хлебопекарных дрожжей, кислота оротовая, агар микробиологический. Добавка к основе питательной среды - сыворотка лошадиная нормальная для бактериологических питательных сред жидкая, аутолизат хлебопекарных дрожжей, аминопептид для микробиологических питательных сред.
Приготовление: в бутылку с основой питательной среды добавляют 100 мл стерильной очищенной воды и выдерживают (30±5) мин, затем помещают на кипящую водяную баню до полного расплавления агара, после расплавления агара выдерживают на водяной бане не более 5 мин. В бутылку с добавкой питательной среды добавляют 24 мл стерильной очищенной воды и выдержать (20±2) мин до полного растворения при температуре 20-25°С. Растворенную добавку переносят в растворенную и охлажденную до температуры (50±2)°С основу Среду размешивают, разливают по 3 мл в стерильные пробирки и скашивают В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9% для увлажнения среды. Среду можно также разливать по 10-15 мл в стерильные чашки Петри. Пробирки или чашки с питательной средой помещают на (24±1) ч в термостате при температуре (37±1)°С для контроля на стерильность. Готовую питательную среду хранят при температуре (6±2)°С до 7 сут.
Принцип действия:
набор реагентов должен обеспечивать рост каждого тест-штамма Neisseria gonorrhoeae "Лошаков" и Neisseria gonorrhoeae "Денисов" при посеве 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10"5 через 24 - 48 часов инкубации при температуре (37 ± 1) °С в виде прозрачных или полупрозрачных бесцветных колоний размером от 0,5 до 2 мм с ровными краями.
Проведение анализа : учет результатов посева проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при температуре (37±1)°С При посеве отделяемого мочеполовых органов больных гонореей рост гонококка на питательной среде должен быть через 24-72 часа. При отсутствии роста гонококка выдержать посевы в термостате до 7 суток.
Упаковка: полиэтиленовые банки по 0,25кг для приготовления 3,6 л среды.
Срок годности- 1 года.
Цена дана с учетом НДС за 1кг.
Эффективность бактериологического метода исследования в
значительной степени определяется качеством питательных сред. В
нашей стране наиболее широко апробированы и используются два вида
питательных сред: асцит-агар и безасцитные питательные среды.
Основой обеих сред является мясопентонный агар (МПА) из мяса
кроликов или свежих бычьих сердец. Методика его приготовления
заключается в следующем. Мясо кролика освобождают от жира и
сухожилий, пропускают через мясорубку или измельчают ножом,
взвешивают, заливают двойным объемом водопроводной воды и в таком
виде оставляют в холодильнике при 4ё на сутки для экстрагирования.
Затем массу нагревают до кипения, кипятят 10 минут, охлаждают и
фильтруют через марлю. К фильтрату добавляют 2% агар-агара, 1%
пептона и 0,5% хлорида натрия, нагревают до растворения агар-агара
и устанавливают рН=7,5-7,6 (подщелачивание производят 20%
раствором едкого натрия). Среду доводят до кипения, фильтруют
через ватно-марлевый фильтр, разливают по стерильным флаконам или
колбам и стерилизуют в автоклаве 15-20 минут при 0,5 атмосферы по
манометру (112ё).
Техника приготовления МПА из свежих бычьих сердец та же,
только кипячение массы измельченных сердец в воде следует
производить 20 минут вместо 10.
Возможно приготовление основы питательной среды без пептона.
При этом пользуются вышеизложенной методикой приготовления МПА, но
исключают из его состава пептон, измельченное мясо кролика кипятят
5 минут вместо 10 и стерилизуют среду в автоклаве в течение 10
минут при 0,8 атмосферы по манометру (117ё).
Асцит-агар
Асцитическая жидкость должна быть получена от больных с
асцитом, причиной которого является сердечная недостаточность, и
производят через троакар в стерильную бутыль и добавляют к ней 5%
хлороформа для наркоза. В течение 10 дней жидкость перемешивают с
хлороформом путем вращения бутыли, затем ее оставляют при
комнатной температуре до полного оседания хлороформа на дно бутыли
и просветления жидкости. После этого по мере надобности прозрачную
асцитическую жидкость разливают по 50 мл в стерильные колбы с
ватными пробками и ежедневно в течение 3 дней их помещают в
водяную баню при температуре 56ё на 1 час для испарения хлороформа
через ватную пробку. После проверки асцитической жидкости на
стерильность она может быть использована для обогащения
питательной среды для выделения гонококка в концентрации 1/3 и 1/4
объема среды, что определяют опытным путем.
Рецепты безасцитных питательных сред
1. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец
(рН=7,4-7,5) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального
белкового питания - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка
крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда КДС-1).
2. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец
(рН=7,4-7,5) - 100 мл, 5% раствор гемогидролизата - 2 мл,
дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого
скота - 20 мл (среда ГДС-2).
3. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец
(рН=7,4-7,5) - 100 мл, среда 199 для культур тканей без
антибиотиков - 20 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови
крупного рогатого скота - 20 мл (среда 199-СДС).
4. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец
(рН=7,4-7,5) - 100 мл, желток свежего куриного яйца - 10 мл,
сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда ЖС).
Яичный желток получают стерильно из диетических куриных яиц
непосредственно перед приготовлением среды. Для этого,
предварительно обработав спиртом, скорлупу вскрывают стерильным
пинцетом и содержимое яйца выливают в стерильную воронку. После
того как белок вытечет, оставшийся в воронке желток переносят в
стерильную посуду и мерной пипеткой берут необходимый для
изготовления питательной среды объем желтка.
Приготовление дрожжевого аутолизата заключается в следующем.
Пекарские дрожжи измельчают и закладывают в бутыль, превышающую по
объему взятые дрожжи в 4 - 5 раз, и оставляют для аутолиза на двое
суток в сушильном шкафу или термостате при 60ё. Затем густую
коричневую массу разбавляют тройным объемом теплой водопроводной
воды, хорошо перемешивают и дважды центрифугируют по 10 минут при
1000 оборотов в минуту (до просветления жидкости). Надосадочную
жидкость сливают, добавляют к ней 0,5% хлористого натрия, доводят
рН до 7,4-7,5 и автоклавируют 30 минут при 1 атмосфере по
манометру (120ё). Хранят в мелкой расфасовке в холодильнике при
Дрожжевой аутолизат может быть заменен 1,5% раствором
экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) в том же количестве (2 мл) 1,5%
раствор ЭКД готовят в лаборатории из сухого ЭКД, растворяя его в
стерильной дистиллированной воде. Приготовленный таким образом
жидкий экстракт разливают по стерильным пробиркам и стерилизуют в
автоклаве при 0,5 атмосферы по манометру в течение 20 минут.
Во всех вышеуказанных питательных средах сыворотка крови
крупного рогатого скота может быть заменена нормальной нативной
сывороткой для бактериологических питательных сред, которая
является той же самой сывороткой, но с добавлением консерванта.
Приготовление обогащенной среды
МПА, находящийся во флаконе или колбе, растапливают в водяной
бане, охлаждают до 56-58ё и добавляют к нему ингредиенты в
соотношениях, указанных ранее в рецептах. Обогащенный МПА по 3-3,5
мл разливают в стерильные пробирки, среду скашивают и увлажняют
0,5 мл стерильного мясопептонного бульона или изотонического
раствора хлорида натрия после того, как она застынет. Для проверки
на стерильность среду помещают в термостат при 35-37ё на сутки.
Все вышеуказанные безасцитные среды, кроме яичной, прозрачны,
на них легко дифференцировать колонии микроорганизмов. Среда,
обогащенная яйцом, отличается мутностью, она желтая, выросшие на
ней колонии, в частности, гонококки, плохо различимы. Однако рост
гонококка на этой среде обильный и его колонии легко могут быть
обнаружены путем обработки роста 1% раствором
диметилпарафенилендиамина или другого реактива на оксидазу,
который окрашивает колонии гонококка в красный цвет, хорошо
контрастирующий на желтом фоне среды. Использование желточной
среды без обработки роста микроорганизмов реактивом на оксидазу не
Качество каждой новой серии питательной среды лабораторного
изготовления необходимо проверять путем посева на нее
патологического материала от больных, у которых бактериоскопически
обнаружены гонококки.
Срок хранения МПА в холодильнике при 4ё не должен превышать 1
месяц, обогащенной среды - 7 суток.
В связи с тем, что для вышеуказанной среды возможен малый срок
хранения, разработана методика производственного изготовления
лиофилизированной безасцитной питательной среды, которая под
названием "Питательная среда для выделения гонококков, сухая"
выпускается в двух флаконах: часть I (основа среды) и часть II
(обогащающие вещества). Для приготовления рабочей среды в часть I
нужно добавить 100 мл стерильной дистиллированной воды и подогреть
в водяной бане при 100ё до полного растворения содержимого флакона
(в пределах 30 минут). Лишнее время выдерживать среду в водяной
бане не следует, т.к. это снижает ее качество. В часть II вносят
24 мл стерильной дистиллированной воды (растворение обогащающих
веществ наступает немедленно). Затем при соблюдении условий
стерильности часть II переносят в охлажденную до 56ё часть I,
смешивают, разливают по стерильным пробиркам, скашивают и
увлажняют как описано ранее.
Сухая среда готовится из кроличьего мяса или бычьих сердец,
помимо приведенных в рецепте 1 (среда КДС-1) обогащающих веществ
она содержит оротовую кислоту в концентрации 1 мкг/мл. Среда
высокого качества, удобна для использования в бактериологических
лабораториях, т.к. для перевода сухой среды в рабочую требуется
лишь стерильная дистиллированная вода.
Использование безасцитной питательной среды с добавлением
антибиотиков и оротовой кислоты дает хорошие результаты при
бактериологической диагностике, в том числе экстрагенительной
гонореи: гонореи миндалин и глотки, прямой кишки. Антибиотики
добавляют для подавления роста сопутствующей гонококку
бактериальной флоры, что повышает интенсивность роста гонококка,
облегчает обнаружение его единичных колоний и выделение в чистой
культуре. Добавляют 20,0 ЕД/мл полимиксина М сульфата и 6,2 ЕД/мл
ристомицина сульфата; вместо последнего можно использовать
линкомицин гидрохлорид - 2 мкг/мл. Оротовую кислоту вводят в
состав питательной среды в количестве 1 мкг/мл.
Для этого берут навеску оротовой кислоты 1 мг (1000 мкг) и
разводят в 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (получают
рабочий раствор, содержащий 1000 мкг который может сохраняться в
холодильнике в течение 10 дней) и стерилизуют в водяной бане 15
минут, затем отбирают 0,1 мл полученного раствора и добавляют к
100 мл обогащенной питательной среды. Среду с антибиотиками
необходимо использовать одновременно со средой без антибиотиков
(одна пробирка со средой с антибиотиками, другая - без них), т.к.
хотя и редко, но встречаются штаммы гонококка, чувствительные к
вышеуказанным антибиотикам.
Среда сохранения (транспортировки)
Состав среды сохранения: 1) 1 литр дистиллированной воды,
свободной от хлора, 30 г агар-агара; 2) 900 мл дистиллированной
воды, свободной от хлора, 2 мл тиогликоловой кислоты, 12 мл 1М
раствора едкого натрия, 100 мл 20% водного раствора натрия
фосфорнокислого однозамещенного, 20 мл 1% раствора хлористого
кальция. Последнюю смесь (2) прибавляют к свежеприготовленному
агару (1), доводят рН до 7,3-7,4, по 10 мл среду разливают в
стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 1 часа.
Ватные тампоны на деревянных палочках или стержнях из
нержавеющей стали диаметром около 2 мм, вмонтированные в ватные
пробки, кипятят 20 минут в фосфатном буфере, рН=7,4, и
импрегнируют в течение 24 часов в 1% водной суспензии тонко
измельченного древесного угля. После высушивания ватные тампоны
подправляют, вставляют в бактериологические пробирки
соответствующего диаметра (равного диаметру пробирок со средой) и
стерилизуют в автоклаве 20 минут при 1 атмосфере (температура
Для приготовления фосфатного буфера готовят два раствора: 1
раствор - в 1 л дистиллированной воды растворяют 28,4 г натрия
фосфорнокислого двухзамещенного (0,2М); 2 раствор - в 1 л
дистиллированной воды растворяют 27,8 г лимонной кислоты (0,1 М).
Смешивают 181,7 мл 1 раствора и 18,3 мл 2 раствора.
Производство посева с использованием среды сохранения
осуществляется следующим образом. Врач, осматривающий больного,
извлекает из пробирки тампон, вводит его в очаг заболевания на
несколько секунд для пропитывания (можно сделать несколько
движений по и против часовой стрелки), извлекает его, не касаясь
окружающих предметов, в пробирку со средой сохранения. Поверх
ватной пробки пробирку закрывают резиновой соской. До отправки
материала в бактериологическую лабораторию посевы сохраняют при 4ё
в холодильнике минимальный срок, но не более суток. Одновременно
берут патологический материал и делают мазки для
бактериоскопического исследования, которые направляют в
лабораторию вместе с посевом. В бактериологической лаборатории
немедленно после поступления тампоны с патологическим материалом
вынимают из среды сохранения и ими производят посев по поверхности
скошенной питательной среды в пробирках. Каждым тампоном делают
посев на питательную среду в двух пробирках. Посев по поверхности
питательной среды следует производить зигзагообразными движениями
вдоль поверхности среды, вращая тампон. Если диаметр пробирок со
средой сохранения и питательной средой аналогичен, можно тампон
после посева оставить во второй пробирке в соприкосновении с
питательной средой. Посевы помещают в термостат и выращивают при
36-37ё в эксикаторе. Следует иметь в виду, что при использовании
среды сохранения рост гонококка может наступить позже, чем при
непосредственном посеве патологического материала на питательную
Работа с культурами
Выращивание гонококков можно производить в пробирках или
чашках Петри; первый способ обеспечивает значительную экономию
среды. Для повышения процента высеваемости гонококков засеянные
питательные среды помещают в термостат в эксикаторе с 20%
реакции между серной кислотой и бикарбонатом натрия: в эксикатор
объемом 5 литров помещают стакан с 50 мл 10% серной кислоты, в
Гонококки имеют бобовидную форму, располагаются в виде диплококков, окружены микрокапсулой, жгутиков не имеют, спор не образуют, аналогично менингоккам. В клеточной стенке имеется наружная мембрана, белки которой подразделяют на три группы по их функциональному значению. Для гонококков характерно наличие пилей, которые отличаются друг от друга по своим антигенным свойствам (16 антигенных вариантов). Гонококки культивируют на питательных средах, содержащих нативный белок (сыворотка крови, асцитическая жидкость). Лучше растут при содержании 3-5% СО2. На асцитагаре образуют прозрачные колонии с ровными краями. Из углеводов ферментируют только глюкозу, образуют каталазу и цитохромоксидазу - типичные для нейссерий ферменты.Антигены
Антигенная структура гонококков изменчива. Это связано с наличием многочисленных антигенных вариантов пилей, которые формируются в процессе развития инфекции.Патогенность и патогенез
Гонококки прикрепляются к цилиндрическому эпителию уретры, влагалищной части шейки матки, прямой кишки, конъюнктиве глаза, а также сперматозоидам и простейшим (трихомонады, амеба). Адгезия происходит за счет пилей и белков наружной мембраны клеточной стенки. Характерной особенностью гонококков является их способность проникать в лейкоциты и размножаться в них. Липоолигосахаридная часть клеточной стенки оказывает токсическое действие. Капсулярные полисахариды подавляют фагоцитоз. Соединяясь с ворсинками цилиндрического эпителия слизистой уретры, а у женщин и эндоцервикального канала, гонококки проникают внутрь клеток при участии белков наружной мембраны клеточной стенки. Это приводит к развитию острого уретрита, цервицита и поражению у женщин шейки матки, придатков (трубы, яичники), у мужчин семенных пузырьков, предстательной железы. При экстрагенитальной локализации гонококки могут повреждать прямую кишку и миндалины, а также вызывать бленнорею (конъюнктивит) у новорожденных. Заражение происходит во время прохождения родовых путей матери, больной гонореей.Иммунитет
При гонорее имеет место гуморальный иммунный ответ. Однако образующиеся антибактериальные антитела не обладают протективными свойствами. В течение заболевания образуются IgA, подавляющие прикрепление пилей возбудителя к клеткам слизистой уретры. Однако они не способны защитить слизистую от последующего заражения другими генерациями гонококков, что связано с изменением их антигенной структуры. Это приводит к реинфекциям и рецидивам, а также к переходу заболевания в хроническую форму.Гонококковые инфекции
Возбудитель гонореи и бленнореи N.gonorrhoeae (по предварительной классификации гонококк) принадлежит к семейству Neisseriaceae, рода Neisseria. В мазках из выделений больных гонококки имеют форму кофейных зерен, грамотрицательные, располагаются парами как внутри лейкоцитов (незавершенный фагоцитоз), так и вне клеток. По своим морфологическим признакам они очень похожи менингококков. Для гонококков присущ полиморфизм - встречаются мелкие и крупные клетки, редко палочковидной формы.К питательных сред очень прихотливы. Лучше растут на средах, содержащих кровь, сыворотку, асцитическую жидкость. Гонококки содержат протеиновые и полисахаридные антигены, по которым разделены на 16 сероваров, но в рутинных баклаборатория их пока не определяют.Для микробиологической диагностики гонококковых инфекций используют бактериоскопический, бактериологический, серологический и аллергический методы.Взятие материала для исследования
Чтобы достойно и доброкачественно провести бактериологическую и бактериоскопическую диагностику, важно правильно взять клинический материал. Его, как правило, должен проводить врач.У мужчин исследуют выделения мочеиспускательного канала, парауретральных ходов, прямой кишки, при показаниях - материал из ротоглотки, а также секрет предстательной железы после ее массажа. Можно также исследовать осадок и "нити" мочи, но в них гонококки выявляются значительно реже. Перед взятием материала из уретры больной не должен помочиться в течение 4-5 ч, не употреблять антимикробные препараты и дезинфицирующие растворы. Наружное отверстие уретры сначала протирают стерильным ватным тампоном, смоченным 0,85% раствором хлорида натрия, затем сухим тампоном. Мазки изготавливают не из навоза, свободно вытекает, а из материала, взятого путем соскоба со слизистой уретры бактериологической петлей или специальной ложечкой Фолькмана. При незначительных выделениях необходимо сделать предварительный массаж уретры. У женщин материал берут из уретры, парауретральных ходов, шейки матки, прямой кишки, а по показаниям - и из ротоглотки. Сначала очищают влагалище от выделений, проводят массаж уретры и путем соскоба бактериологической петлей или ложечкой Фолькмана забирают материал. Шейку матки сначала протирают сукиным стерильным ватным тампоном для удаления слизистой пробки. Выделения из канала шейки матки берут бактериологической петлей или пинцетом. Материал из дистального отдела прямой кишки берут с помощью ложечки Фолькмана слепым методом ", т.е. без какой-либо подготовки больного, или с помощью рекоскопа или ректального зеркала. В этом случае изучаемый материал забирают непосредственно из видимого места поражения.При орофарингеальном гонореи слизь из ротоглотки берут стерильными ватными тампонами на специальных держателях из стальной проволоки. Для диагностики "ленореи выделение конъюнктивы снимают бактериологической петлей. Редко гонорея осложняется гоносепсисом, эндокардитом, артритом. Тогда материалом для юслидження служит кровь или синовиальная жидкость. Принимая во внимание высокую - V тливисть гонококков к колебаниям температуры, исследуемые материалы доставляют в лабораторию в специальных термосах или сумках с грелкой.Бактериоскопическое исследование
Бактериоскопическое исследование является наиболее распространенным, хотя и менее чувствительным методом лабораторной диагностики гонореи и бленнореи по сравнению с выделением-истих культур. Это особенно касается хронического течения болезни, когда в исследуемом материале содержится незначительное количество гонококков. Однако при правильном взятии материала, повторных обследованиях пациентов, применении методов провокации, квалифицированной оценке мазков бактериоскопическое исследования достаточно часто дает возможность быстро и верно диагностировать заболевание.С исследуемого материала изготавливают два тонких равномерные препараты-мазки. Один окрашивают метиленовой синькой, второй-по методу Грама. При отсутствии метиленового синего можно окрашивать один мазок 1% водным раствором кристаллического фиолетового или 0,5% раствором бриллиантового зеленого течение 1 мин. Заключение о наличии гонококков делают, основываясь на таких ихсвойствам: грамотрицательные окраску, диплококова структура, форма кофейных зерен, расположение внутри лейкоцитов.Под влиянием антибиотиков и других химиопрепаратов а также при хронической гонорее морфология и окраски гонококков могут меняться. Отдельные клетки приобретают различную форму и величину (так называемые формы Аша). Кроме того, в исследуемом материале могут находиться подобные гонококков грамотрицательные кокки из рода Veillonella. Это в некоторой степени ограничивает диагностическую ценность метода первичной микроскопии.Лучшие и надежные результаты дает метод иммунофлюоресценции. Тонкие мазки из выделений больных фиксируют в пламени горелки. На них наносят меченую изотиоцианатом флуоресцеина антигонококову сыворотку на 1 час при 35 ° С во влажной камере. После этого мазки дважды промывают буферным раствором, наносят забуферений глицерин и покрывают покровной стеклами. При взаимодействии гонококков с мечеными антителами под люминесцентным микроскопом видно характерное свечение вокруг бактериальных клеток.Бактериологическое исследование
Показаниями к выделения чистых культур гонококков неоднократные отрицательные результаты бактериоскопии, наличие подозрительных по гонококков, но не идентифицированных морфологически микроорганизмов, а также для достоверного установления излеченности заболевания. Очень важно немедленно поместить посевы в термостат. При невозможности проведения посевов на месте взятия материала можно висел ватным тампоном в пробирку с транспортным средой Стюарта, которое обеспечивает сохранение жизнеспособности гонококков во время доставки в лабораторию.Посевы проводят по стандартной схеме в один из специальных питательных сред в пробирках или чашках Петри (КДС, Бейли, кровяное или сывороточный агар, сухой питательной среды Харьковского предприятия "Биолек" по производству бактериальных и лекарственных препаратов). Для диагностического культивирования гонококков во многих странах используют еще "шоколадный" агар. Наилучшими являются среды, изготовленные на основе агара из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец. Добавление к ним 20 ЕД / мл полимиксина и 2 мкг / мл линкомицина значительно повышает частоту высева гонококков, поскольку указанные препараты подавляют рост других бактерий. Все среды перед посевом подогревают в термостате в течение 15-20 мин. Чашки и пробирки с посевами помещают в эксикаторы, где создают атмосферу с 20% С02. Колонии, как правило, вырастают через 18-24 ч, однако возможен и поздний рост. Тогда посевы выдерживают в термостате (в эксикаторе!) До 8 суток, ежедневно проверяя появление роста.Колонии гонококков, выросшие имеют круглую, слегка выпуклую форму, ровные края, блестящую поверхность, слизистую консистенцию. Они прозрачны, как капельки росы, почти бесцветные, хотя могут случаться и беловатые варианты. Полученные колонии исследуют макро-и микроскопически. В мазках гонококки располагаются парно, тетрадами и скоплениями. Типичные колонии пересевают на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры. Окончательную идентификацию проводят, учитывая морфологические, культа рал ьни, ферментативные и антигенные свойства. Биохимически гонококки мало активны. На сывороточных средах с 1,5% различных углеводов они раскладывают только глюкозу, но не мальтозу и сахарозу.Оксидазно активность выделенных культур определяют путем нанесения на колонии (после микроскопии) 1% раствора диметилпарафенилендиамину. Оксидазопозитивни колонии сначала краснеют а позже чернеют.Дифференциация гонококков от других видов рода Neisseria имеет особое значение при диагностике орофарингеальной гонореи. Как известно, на слизистой миндалин, рото-и носоглотки постоянно находится большое количество грамотрицательных нейссерий - представителей нормальной микрофлоры человека. Надежными методами идентификации гонококков являются реакции иммунофлюоресценции, латекс-и коаглютинации а также определения ферментативных свойств. Обязательно проводят качественное определение чувствительности или резистентности микроорганизмов к антибиотикам с помощью метода диффузии в агар с использованием дисков.С целью повышения частоты нахождения гонококков в мазках при первичной микроскопии и более надежного выделения чистых культур особенно в случаях вялого, хронического течения заболевания прибегают к методам провокации гонореи, то есть искусственного обострения патологического процесса, в результате чего в выделениях появляется большее количество гонококков. Основными из этих методов являются:а) химический - инстилляция в уретру 0,5% раствора нитрата серебра у мужчин, смазывание канала шейки матки 2-5% раствором нитрата серебра;б) механическое - введение прямого бужа в уретру на 10 мин, или проведения передней уретроскопии;в) биологический - внутримышечное введение гоновакцины в количестве 500 млн. микробных тел или пирогенала 200 МПД;г) алиментарный - употребление соленой, острой пищи;д) термический - прогревание половых органов индуктотермичним током;е) физиологический - взятие мазков во время менструаций.Еще лучше комбинировать несколько методов провокации, например, химический, алиментарный и биологический.В последнее время для более надежного выявления возбудителя гонореи принимают полимеразной цепной реакции. Она позволяет выявить возбудителя в случаях хронической гонореи, когда бактериоскопическое и бактериологическое исследование не дает положительных результатов.Серологическая диагностика
Серологическую диагностику гонореи осуществляют сравнительно редко, в основном, при хроническом ее течении, когда бактериоскопическое и бактериологические исследования не дают положительных результатов. В современных условиях проводят иммуноферментный анализ, РНГА и реакции Борде-Жангу (РСК). Антигенами для этих реакций служат: убита нагревом поливалентная гонококковая вакцина, вакцина, инактивированная ультразвуком, протеиновые и полисахаридные фракции гонококков, а также пиридиновый антиген. ИФА и РНГА является высокоспецифичным и достоверными серологическими реакциями. По сравнению с прошлым РСК несколько утратила свою роль. Она не имеет практического значения при диагностике острой гонореи, поскольку ее лечат еще до образования значительного количества антител. Для установления достоверности излечения она вообще непригодна. Реакция Борде-Жангу имеет важное значение при серодиагностици хронической гонореи, особенно при осложненных его формах (гоносепсис, метрит, артрит простатит и др.).Диагностическое значение аллергических проб несколько обесценивается тем, что они положительные течение многих лет после перенесенной гонореи. Для их постановки внутрикожно вводят 0,1 мл свежей гонококковой вакцины (100 млн микробных клеток в 1 мл). Через 24 ч наблюдают гиперемию, иногда с отеком в центре.Лечение и профилактика
Для химиотерапии гонореи используют антибиотики: бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины) и другие антибиотики. Вакцинопрофилактика гонореи не проводится ввиду отсутствия эффективных вакцин. Для предупреждения бленнореи всем новорожденным закапывают на конъюнктиву глаза раствор одного из перечисленных антибиотиков.Этот агар с добавлением крови, гемоглобина или других добавок рекомендуют для селективного выделения гонококков.
Состав**:
** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам
Приготовление:
Размешать 7,2 г порошка в 100 мл дистиллированной воды, чтобы приготовить среду двойной концентрации. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50°С и асептично добавить приготовленные отдельно 100 мл 2%-ного стерильного раствора гемоглобина (FD022 ) и добавку GC (FD021 ). Тщательно перемешать и разлить в чашки Петри. Для придания селективных свойств в среду можно добавить антибиотики, входящие в следующие добавки: VNC (FD023 ), VCNT (FD024 ), Linco T (FD026 ), Vanco (FD028 ).
Для приготовления шоколадного агара готовят среду обычной концентрации, размешав 3,6 г порошка в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют, добавляют до 5% (об/об) стерильную дефибринированную кровь и прогревают среду при 80°С в течение 10 мин.
Принцип и оценка результата:
Данный агар с добавлением крови или гемоглобина и других добавок рекомендуют для селективного выделения и культивирования таких прихотливых микроорганизмов, как гонококки и гемофильные бактерии. Johnston разработал шоколадный агар, на котором можно было в течение 24 ч получить рост Neisseria gonorrhoeae (1). Позже другие авторы (2) усовершенствовали среду, введя в ее состав гемоглобин.
Агар содержит специальный пептон – источник питательных веществ для микроорганизмов. Крахмал позволяет нейтрализовать образуемые нейссериями токсические вещества, а фосфаты противодействуют сдвигу рН в результате образования аминов, что также может сказаться на росте и жизнеспособности микроорганизмов. Гемоглобин служит источником фактора Х для гемофильных бактерий. Другая добавка обогащает среду фактором V (НАД, никонинамидадениндинуклеотид), необходимым для гемофильной палочки, а также аминокислотами, витаминами, ионами железа и т.п., что стимулирует рост патогенных нейссерий.
Не применяйте тампоны из хлопка для сбора материала. Посев осуществляйте сразу после отбора материала. Его надо сделать так, чтобы были зоны густого и редкого роста. Посев инкубируют при 37°С в атмосфере 5-10% углекислоты и 70% влажности. Все подозрительные колонии надо проверить в биохимических и/или серологических тестах.
Контроль качества:
Внешний вид порошка:
Гомогенный сыпучий светло-желтый порошок.
Плотность готовой среды:
Образуется среда, соответствующая по плотности 1,0%-ному агаровому гелю.
Цвет и прозрачность готовой среды:
Основа среды имеет светло-желтую окраску, прозрачна или слегка опалесцирует. После добавления гемоглобина среда становится шоколадно-коричневой и непрозрачной, если в чашках Петри формируется гель.
Кислотность среды:
При 25°С водный раствор (3,6% вес/об) имеет рН 7,2 ± 0,2.
Культуральные свойства:
Ростовые характеристики референс-штамма через 40-48 ч при 35-37°С на шоколадном агаре, приготовленном на этой основе, в присутствии в атмосфере 5-10% углекислоты и 70% влажности.
